蝴蝶兰的组培快繁技术

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蝴蝶兰属热带气生兰,花形似蝴蝶,因而得名。其花形态美丽,色彩丰富,花期长,在热带兰中有兰花皇后之美称,是近年来最受欢迎的洋兰之一。蝴蝶兰是单茎性气生兰,植株极少发育侧芽,且种子极难萌发,对其进行常规性的繁殖,增殖速度很慢。因此,多采用组织培养的方法对其进行快速繁殖,以达到工厂化育苗的目的。

1.外植体

蝴蝶兰的快速繁殖可选用的外植体有茎尖、茎段、叶片、花梗腋芽、花梗节间、根尖等,其方法各异,难度各有高低。

2.采样、消毒与初代培养

选用的外植体不同,其采样、消毒与初代培养的方法也不相同。下面分别就各种方法做一介绍:

(1)花梗腋芽培养

将蝴蝶兰花梗剪下,用75%酒精棉球擦拭,切成约5厘米的每节带芽小段,仔细除去苞片,防止伤及嫩芽,然后用2%次氯酸钠溶液消毒20分钟,其间不停地摇动。消毒后用无菌水冲洗3～5次,放到培养皿中。用4号解剖刀将两端各切去0.5厘米,芽体朝上插接在1/2MS+3毫克/升6苄基腺嘌呤培养基上。培养基中还需加入蔗糖20克/升,水解乳蛋白1克/升,琼脂8克/升,活性炭1克/升,调pH值为5.6。

(2)茎尖培养

茎尖是组培成功率较高的部位,但蝴蝶兰的茎尖深藏于叶片夹缝中,分离和消毒都比较困难。茎尖的取材有两种方法:一是将除去叶片的茎用水冲洗,再用10%的漂白粉溶液作表面灭菌15分钟(每100毫升消毒液加1滴吐温20),除去叶原基后,再用5%漂白粉液灭菌10分钟,然后用无菌水冲洗。

切取茎尖和各叶基部的腋芽,大小约2～3毫米,接种到培养基上,用添加15%椰乳的VW培养基进行液体培养,或加9克/升琼脂进行固体培养。培养温度为25℃,光强2000勒克司,每天光照时间为16～24小时。液体培养以160转/分钟速度做震荡培养,7～10天再转至新培养基。从开始培养算起,1个月后转到固体培养基。在这种条件下培养1个月即可形成原球茎状球体,以后可继代增殖。二是先诱导花梗侧芽成为植株,再利用试管苗的茎尖进行培养。其方法是:在双目镜下剥取约0.3毫米大小的茎尖,接种到MS(附录表11)+3毫克/升6苄基腺嘌呤固体培养基上,在温度(252)℃,光强1500勒,每天光照10小时条件下培养。14天可见茎尖膨大,呈浅绿色半球状,3个月后,长成桑果状原球茎状体,组织块6毫米。此方法最大的优点是免去了外植体消毒的程序,成功的可能性较大。

(3)花梗节间的培养

正在伸长的蝴蝶兰幼嫩花茎具有分化原球茎的能力,因此可采用快速伸长的花梗节间作培养材料。从花梗可见至其后的45天之间,全部幼嫩花序以及花梗等具有细胞分裂能力的节间组织,最有利于诱发原球茎形成,成功率可达62.9%～77.1%。从第一花蕾可见起,随花梗的发育分化,原球茎的比率下降,能作为外植体的节间也愈短。具体操作方法为:切取花梗节间,进行表面消毒,然后斜切成1～1.5毫米厚的薄片,平放在固体斜面培养基上。培养基配方为:1.2倍的VW无机盐,加100毫克/升肌醇,维生素B1、B6和烟酸各0.5毫克/升,1毫克/升6苄基腺嘌呤,2%蔗糖,0.8%琼脂。置温度(262)℃,光强500勒,每天光照16小时的环境下培养。

(4)叶培养

从3～4月龄蝴蝶兰植株上取幼叶,用自来水冲洗干净。在超净工作台上,叶片用75%酒精消毒30秒,然后用无菌水清洗2～3遍,再用0.1%升汞溶液浸泡11分钟,最后用无菌水冲洗4～5遍。用无菌手术刀将叶片切成5平方毫米左右大小的小块,平放或按极性接种在MS+3.0毫克/升6苄基腺嘌呤+0.2毫克/升萘乙酸诱导培养基上(培养基中加入蔗糖20克/升,琼脂12克/升,椰汁200毫升/升),近轴面向上。培养条件为:温度25～28℃,光强1600～2000勒,每天光照10～12小时。幼叶切块在诱导培养基上培养1～2个月后,从每个叶片组织块上可产生1～7个不等的原球茎。

(5)根组织培养

取正在培养的花梗苗,切取根尖长约1～1.5厘米,并用解剖刀切去尖端约1毫米,露出根的分生组织,接种于根尖诱导培养基MS+8～12毫克/升6苄基腺嘌呤+0.5～1.0毫克/升萘乙酸+10%椰乳,附加3%蔗糖,培养基中加入一块泡沫海绵,pH5.4～5.6;液体震荡培养(30转/分钟),培养温度(272)℃,光强1000～2000勒,每天光照10小时。20天左右材料膨大且表面颜色明显变深,60天后根分生组织部位开始有分化芽,分化率约为60%。再过45天左右,切下分化芽,转入原球茎诱导培养基2/3MS+1～3毫克/升6苄基腺嘌呤+0.5～1.0毫克/升萘乙酸+10%椰乳,加蔗糖3%,琼脂0.7%。经2个月可形成原球茎。

3.继代培养

蝴蝶兰早期原球茎状球体外观象瘤状愈伤组织,继续培养可见表面突起一个个圆球,部分表面细胞分化出根毛状物。在原球茎球状体形成后,无菌条件下将原球茎取出切割成几小块,切块不可太小(直径2毫米),转入MS+2.0毫克/升6苄基腺嘌呤+0.5毫克/升萘乙酸(加蔗糖20克/升,琼脂12克/升,椰汁200毫升/升)继代培养基中,进行增殖培养。或在原球体的诱导时,以1/2MS为基本培养基,激素以2毫克/升6苄基腺嘌呤+0.2毫克/升萘乙酸,配方中均加入糖20克/升,琼脂8克/升,调pH值5.6,也可获得理想的效果。培养60天左右,再进行分割转移。通过这种方式,原球茎可成倍增长。

4.小植株的培养

将不需继代的原球茎,在无菌条件下,切开丛生小植株,将小植株转入育苗培养基上培养。育苗培养基可选用1/2MS+1.5毫克/升吲哚丁酸+0.05毫克/升萘乙酸,并加入蔗糖20克/升,琼脂12克/升,活性炭5克/升,椰汁200毫升/升;或2/3MS+香蕉100克/升,加蔗糖30/升,琼脂7克/升。此后,将其转入1/2MS+0.8毫克/升萘乙酸的生根培养基。不久,小植株生根。当小植株长到一定大小时,移入温室。切离丛生小植株时,基部未分化的原球茎及刚分化的小芽应接入诱导培养基中,作为种苗。一段时间后,将长大的种苗移出,种植,小苗及原球茎可继续增殖与分化。

5.试管苗出瓶移栽

当小植株长至4厘米左右,叶3～4片,根2～3条时,即可移栽。此时将小植株带瓶移入温室内,1～2周后,再将瓶塞半开或完全打开炼苗3～5天后,取出组培苗,用自来水洗净其根部的培养基,将根部放于50%多菌灵水溶液中消毒2小时,药液浓度为1000倍,晾干后即可栽植于水苔穴盘中。刚定植的植株,温度白天以20～25℃为宜,夜间以18～23℃为宜。以后,温室内日温以25～29℃为宜,夜温以20～24℃为宜。湿度以80%～90%为好,以后逐渐保持在70%左右。初期光照不宜太强,一般以1500～2500勒为佳。多采用遮阳网,春秋用一层遮阳网遮光50%左右,夏季用双层遮阳网,遮光70%左右,冬季可适当减少遮荫。缓苗后(两周左右)逐步提高光照强度至6000～8000勒。蝴蝶兰根部忌积水,水分过多,易引起根系腐烂。刚出瓶的小苗应勤补水,中苗或大苗根据干湿程度浇水;一般情况下,在盆内基质表面已变干,盆面水草微发白时再浇水。春季可4～5天浇水1次,保持盆内基质潮湿即可。浇水时要让整个基质湿透。浇水时间以上午或清晨为佳。幼苗移栽初期不可施肥,定植后1个月,可喷施液肥。

一、农业上的应用

1. 快速繁殖种苗(rapid propagation)

用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。

快速繁殖可用下列手段进行：

⑴通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；

⑵通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；

⑶通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。

试管快速繁殖应用在下列生产或研究中：

(1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系等。

(2)繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。

(3)繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。

由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。

2.无病毒苗(virus free)的培养

植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重，甚至会造成极严重的后果。

自从Morel l952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。

对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。

组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用。如马铃薯，甘薯，草莓，苹果，香石竹，菊花等。而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心，这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个规范的系统程序，从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。

3. 在育种上的应用(breeding)

植物组培技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工作在新的条件下更有效的进行。

⑴倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显。

⑵克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）

⑶保存种质

例如：用花药培养单倍体植株；

用原生质体进行个体细胞杂交和基因转移；

用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精，以及种质资源的保存等等。

胚培养技术很早就有利用，在种属间远缘杂交的情况下，由于生理代谢等方面的原因，杂种胚常常停止发育，因此不能得到杂种植物，所以通过胚培养就可保证远缘杂交的顺利进行。

到50年代在实践上的应用就更多了。如在桃、柑橘、菜豆、南瓜、百合、鸢尾等等许多园艺植物远缘杂交育种上都得到了应用。大白菜X甘蓝的远缘杂交种"白兰"，就是通过杂种胚的培养而得到的。

对早期发育幼胚因太小 难以培养的种类，还可采用胚珠和子房培养来获得成功。利用胚珠和子房培养也可进行试管受精 ，以克服柱头或花柱对受精的障碍，使花粉管直接进入胚珠而受精。花药、花粉的培养在苹果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺葵等约20 种园艺植物得到了单倍体植株。

在常规育种中为得到纯系材料要经过多代自交，而单倍体育种，经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体，大大缩短了育种的世代和年限。

利用组织培养可以进行突变体的筛选。突变的产生因部位而异，茎尖遗传性比较稳定，根、茎、叶乃至愈伤组织和细胞的培养则变异率就较大。培养基的激素也会诱导变异，因浓度而不同。此外还可采用紫外线、x射线、Y射线对材料进行照射，来诱发突变的产生。

在组织培养中产生多倍体、混倍体现象的比较多，产生的变异为育种提供的材料，可以根据需要进行筛选。利用组织培养，采用与微生物筛选相似的技术，在细胞水平上进行突变体的筛选更加富有成效。原生质体培养和体细胞杂交技术的开发，在育种上展现了一幅崭新的前景。已有多种植物经原生质体培养得到再生植物，有些植物得到体细胞杂种，无论在理论和实践上都有重要价值。随着这方面工作的深入和水平的提高，原生质体培养一定会在育种上产生深远的影响。

4. 工厂化育苗(industrializing propagation)

近年来，组织培养育苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段，在园艺植物的生产领域蓬勃发展。

⑴含义：是指以植物组织培养为基础，将外植体接种在人工配制的培养基上，通过控制环境条件，使细胞脱分化、再分化成新的组织、器官，进而培育出与母株一样的批量幼苗的方法。例如：非洲紫罗兰组织培养育苗的工厂化生产。

⑵特点：繁殖快，整齐、一致，无病虫害，周期短，周年生产，性状稳定。

⑶作用：有利于繁殖系数低、杂合材料的快速繁殖

有利于有性繁殖优良性状易分离材料的繁殖

有利于保持从杂合的遗传群体中筛选出的表现型优异植株的优良遗传性。

组织培养育苗的无毒化生产，还可减少病害传播。

可以减少气候条件对幼苗繁殖的影响，缓和淡、旺季的供需矛盾。

⑷现状： 世界上一些先进国家园艺植物组织培养技术的迅速发展从60年代就已经开始，并随着生长、分化规律性探索的逐步深化，到了70年代仅花卉业就已在兰花、百合、非洲菊、大岩桐、菊花、香石竹、矮牵牛等二十几种花卉幼苗生产上建立起大规模试管苗商品化生产。

到1984年世界花卉幼苗产业的生产总值已达20亿美元，其中美国花卉幼苗市场总值为6亿多美元，日本三友种苗公司有60％的幼苗靠组织培养技术繁殖。1985年仅兰花一项，在美国注册的公司就有100余家，年销售额在1亿美元以上。

由于组织培养技术的应用，加快了花卉新品种的推广。以前靠常规方法推广一个新品种要几年甚至十多年，而现在快的只要1～2年就可在世界范围内达到普及和应用。

我国采用快速繁殖技术，也使优良品种达到迅速的推广和应用。如广东切花菊"黄秀风"的应用，使菊花变大，长势加强，花色鲜艳，抗病力增强，打开了进入香港市场的渠道，使30多种观叶植物的推广很快遍及全国，丰富了人们的生活，并将自然界的几百个野生金钱莲品种繁种驯化，培养了一批园林垂直绿化的材料，促进了园林业的发展。

⑸制约：植物组织培养也存在一定的困难。

首先是繁殖效率与商品需 要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解决，因而无法满足生产的需要。其次是在培养过程中如何减少变异株的发生。更重要的是应降低组培苗工厂化生产的成本，只有降低成本，才能更好的投产应用。

总之，随着组织培养这一技术的发展及各种培养方法的广泛应用，使这一技术在遗传育种、品种繁育等方面表现出了巨大的潜力，特别是生物工程和工厂化育苗实施以后，它将以新兴产业的面目在技术革命中发挥重大作用。

二、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、 胚胎学、基因工、生物工程等方面的应用

要揭开生命活动的秘密，需要多科学、多技术的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等提供了一种有效、快速的方法。

因为要揭示生命的奥秘，首先要研究单个基因的作用，研究它在细胞内是如何组装的，如何与其它基因发生联系，如何表达和调控等。分离单个基因，对它DNA 进行测序，再对其中的某些碱基实行突变，然后还需要将基因送到受体细胞当中，看表达情况，以确定其功能。接受基因的受体细胞要产生再生植株，就需要通过组织培养的方法才能实现。

三、 利用组织培养的材料作为植物生物反应器

中国的中草药是一份人类宝贵的财富，但很多种中草药资源匮乏，产量不足，甚至濒于灭绝。如果能利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产，不再依附于自然环境，不仅可以解决现有困难，而且可以通过筛选高产有效成分的细胞系，来提高其药用价值。

比如用培养的人参悬浮细胞，来生产人参皂苷，已在日本等国家形成规模。利用培养的植物细胞和组织细胞作为生物反应器，也可以生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜生产乙肝疫苗正在实验中。

四、用于其它未知科学的研究

现代科学发展非常迅速，很多现在预想不到的事情都有可能发生，新发明、新发现、新创造层出不穷，今天认为不可能的东西明天就可能变成现实。植物组织培养也同样具有许多尚未发掘出的潜力，说不定有一天人们会在三角瓶内种出大南瓜。

总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶段，远远没有达到它的高峰期，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力还远远没有发挥出来。相信在今后的几十年内，组织培养在我国将会有更大的发展，在农业、制药业、加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大的经济效益。

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